Оценка показателей углеводного и липидного обмена у крыс в зависимости от вида высококалорийного питания

ОБОСНОВАНИЕ

В настоящее время наблюдается увеличение числа лиц, страдающих ожирением и ассоциированным с ним рядом заболеваний. Это в основном определяется адинамичным образом жизни и нездоровым высококалорийным питанием с преобладанием в рационе жиров преимущественно животного происхождения и простых углеводов, в частности фруктозы. Фруктоза, производимая из дешевого сырья — кукурузы, на сегодняшний день является доступной формой углеводов. Кажущаяся на первый взгляд безопасность этого моносахарида при избыточном потреблении может привести к значительным изменениям в обмене веществ наряду с высокожировым питанием. Следствием данных метаболических нарушений является риск развития таких заболеваний, как метаболический синдром, сахарный диабет 2 типа, стеатогепатоз и, как следствие, сердечно-сосудистые заболевания, которые являются ведущей причиной смерти среди населения на сегодняшний день [1].

Ранее проводились исследования по изучению влияния высококалорийного питания на основе диеты с повышенным содержанием жира (10% от общего рациона) на показатели углеводного обмена и формирование инсулинорезистентности, но липидный обмен изучен недостаточно полно [2].

В других работах опубликованы результаты по моделированию фруктозо-индуцированного метаболического синдрома при назначении крысам 10% раствора фруктозы в течение 6 нед [3]. Авторы пришли к выводу, что для развития классического метаболического синдрома необходимо использовать более высокую концентрацию фруктозы в более длительные сроки.

Также было показано, что диета, содержащая в своем составе растительные жиры наряду с животными (суммарно 42% от суточного рациона), вызывает увеличение массы тела, отложение триглицеридов в печени, снижение чувствительности к инсулину, но не приводит к развитию стеатоза и фиброза печени [4]. А назначение диеты, содержащей жир только животного происхождения (40% от общей калорийности), вызывает развитие стеатоза печени у крыс [5].

Таким образом, в опубликованных ранее работах недостаточно целостной информации по изучению показателей углеводного и липидного обмена при назначении диеты с достаточно высоким содержанием фруктозы и жира, и их сравнительной характеристики в одинаковых условиях проведения эксперимента.

В нашем исследовании мы предварительно проанализировали информацию по результатам ранних работ, разработали состав диет и время их назначения крысам. Учитывая одновременную постановку запланированных серий, имели возможность провести сравнительный анализ исследуемых показателей.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить и сравнить основные показатели углеводного и липидного обмена при фруктозообогащенной диете и диете с высоким содержанием жира в условиях эксперимента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Место и время проведения исследования

Место проведения. Ижевская государственная медицинская академия, Ижевск, Россия.

Время исследования. 5 октября 2019 г. — 9 ноября 2019 г.

Изучаемые популяции (одна или несколько)

Изучалась одна популяция крыс, разделенная на 3 группы, — 2 опытные и 1 контрольную.

Критерии включения: беспородные белые крысы, пол — самцы, возраст 4–5 мес.

Способ формирования выборки из изучаемой популяции (или нескольких выборок из нескольких изучаемых популяций)

Произвольный.

Дизайн исследования

Интервенционное проспективное (обследования на 21, 35 и 60-й день эксперимента), одновыборочное контролируемое рандомизированное исследование.

Рандомизацию животных проводили методом случайных чисел. Заносили номера клеток с крысами и свободных клеток в компьютер, затем запускали генератор случайных чисел, в соответствии с которым переносили крыс в нужные клетки. Сформировали 3 группы животных.

1.Контрольная группа (n=15) — интактные здоровые крысы, у которых значения изучаемых показателей использовали для расчета контрольных величин.

2.Опытная группа 1 (n=15) — крысы, которым была назначена диета, обогащенная фруктозой.

3.Опытная группа 2 (n=15) — крысы, находившиеся на диете с повышенным содержанием жира.

Описание медицинского вмешательства (для интервенционных исследований)

Животным опытной группы 1 была назначена диета, обогащенная фруктозой, содержащая 60% фруктозы от суточного рациона (161,5 ккал в сутки на 1 крысу). Крысы опытной группы 2 получали питание с повышенным содержанием жира — 44% общей калорийности рациона (231,4 ккал в сутки на 1 крысу). На соответствующих диетах крысы находились в течение 35 дней. С 36-го по 60-й день животные двух опытных групп, как и крысы контрольной группы, находились на стандартном рационе вивария (74,4 ккал в сутки на 1 крысу). Грызуны всех групп имели свободный доступ к питьевой воде. На 21, 35 и 60-й день оценивали показатели липидного спектра и углеводного обмена. Декапитацию крыс проводили натощак под кратковременным эфирным наркозом на 21, 35 и 60-й день эксперимента. Кровь собирали из шейной вены в стеклянные пробирки с крышками.

Методы

Из крови крыс путем центрифугирования при 3000 об./мин в течение 15 минут получали сыворотку крови.

В сыворотке крови исследовали содержание глюкозы, холестерина (ХС), липопротеинов высокой (ЛПВП) и низкой (ЛПНП) плотности, триглицеридов (ТГ) на автоматическом биохимическом анализаторе AU-480 (Beckman Coulter, США) с использованием соответствующих тест-систем этого же производителя по инструкциям к наборам. Концентрацию инсулина определяли методом иммуноферментного анализа с помощью тест-системы ELISA Kit for Insulin (Rat) (США) в соответствии с инструкцией к набору. Следующие показатели рассчитывали по формулам:

индекс атерогенности (ИА) = (ХС-ЛПВП)/ЛПВП;

индексы инсулинорезистентности:

HOMA (Homeostasis Model Assessment) = глюкоза (ммоль/л) × инсулин (мкЕд/мл) / 22,5;

CARO (F. Caro, 1991) = глюкоза (ммоль/л) / инсулин (мкЕд/мл).

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов проводили по программе Statistica 10. В связи с тем, что полученные данные не подчинялись закону нормального распределения (по тесту Шапиро–Уилка), для расчета достоверности отличий использовали непараметрический критерий Манна–Уитни. Различия в результатах считались достоверно значимыми при p<0,05. В связи с отсутствием статистически значимых отличий в значениях показателей контрольных групп по дням эксперимента, в расчетах использовали их среднее арифметическое.

Данные представлены в виде медианы с 1-м и 3-м квартилями — Ме [Q1; Q3].

Этическая экспертиза

Исследование одобрено локальным этическим комитетом Ижевской государственной медицинской академии (протокол заседания № 652 от 23.04.2019).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для исследования были отобраны 45 беспородных крыс с начальной массой тела 230–270 г, которых разделили на 3 группы по 15 животных в каждой — 2 опытные и 1 контрольная.

У крыс как 1-й, так и 2-й опытных групп наблюдалось увеличение всех исследуемых показателей углеводного и липидного обмена по 3 временным точкам эксперимента (табл. 1). Однако можно отметить более выраженный рост концентрации глюкозы, ХС, ТГ, ЛПНП, ИА и ЛПВП у животных, которые получали диету с повышенным содержанием жиров. У животных опытной 1-й группы наряду с повышением содержания глюкозы можно отметить статистически значимое увеличение концентрации инсулина по дням эксперимента.

НЕЖЕЛАТЕЛЬНЫЕ ЯВЛЕНИЯ

В ходе эксперимента нежелательные явления отсутствовали.

ОБСУЖДЕНИЕ

По представленным в таблице результатам, наблюдается рост содержания компонентов липидного профиля — ХС, ЛПНП, ЛПВП, ТГ — в динамике эксперимента. Причем, наиболее выраженный для 2-й группы крыс, находившейся на жировой диете.

Рост показателей липидного обмена у животных опытной 2-й группы может быть связан как с увеличенным потреблением экзогенных липидов и преобразованием их в эндогенные, так и с активацией липолитических процессов с образованием ацетил-КоА. Большая часть ацетил-КоА расходуется на энергетические затраты организма, избыток идет на синтез холестерина, кетоновых тел, свободных жирных кислот [9]. Последние, взаимодействуя с глицерофосфатным остовом, образуют ТГ, а также участвуют в образовании ЛПНП. Увеличение концентрации ЛПВП может носить компенсаторный характер, учитывая предрасположенность грызунов к синтезу преимущественно данной формы липопротеинов.

Повышенное содержание жиров усиливает процессы свободнорадикального окисления липидов с модификацией клеточных мембран и рецепторных структур, результатом чего является снижение восприимчивости клеток и тканей к инсулину. Известно также, что жировая ткань служит мощным эндокринным органом, секретирующим гормоны, хемокины, цитокины, такие как интерлейкин-1,6, фактор некроза опухолей, резистин, лептин, которые ингибируют сигнал инсулина в тканях-мишенях, приводя к инсулинорезистентности [10]. Об этом свидетельствуют отличные от контроля индексы инсулинорезистентности в нашем опыте (см. табл. 1).

Наряду с увеличением фракции атерогенных липопротеинов наблюдается развитие атеросклеротических изменений в сосудистой стенке, косвенным признаком которых является индекс атерогенности.

Помимо этого, отмечается увеличение содержания показателей углеводного обмена в ходе эксперимента, в большей степени представленное во 2-й опытной группе крыс. Данное повышение может быть обусловлено как сформировавшейся инсулинорезистентностью, так и активацией глюконеогенеза, инициатором которого является избыточное накопление ацетил-КоА и глицерина как результат усиленного расщепления жиров [11]. При этом рост содержания инсулина в эксперименте был более выражен при назначении фруктозообогащенной диеты.

Известно, что значительное количество фруктозы, прежде чем поступить в систему воротной вены, превращается в глюкозу уже в клетках кишечника. Оставшаяся часть фруктозы всасывается путем облегченной диффузии с помощью белка-переносчика. Метаболизм фруктозы начинается с реакции фосфорилирования, катализируемой фруктокиназой с образованием фруктозо-1-фосфата. Следует отметить, что включение фруктозы в метаболизм через фруктозо-1-фосфат минует стадию, катализируемую фосфофруктокиназой, которая является пунктом метаболического контроля скорости катаболизма глюкозы [12]. Этим обстоятельством можно объяснить, почему увеличение количества фруктозы ускоряет в печени процессы, ведущие к синтезу жирных кислот, а также их этерификацию с образованием триглицеридов, увеличение содержания которых отмечается и в нашем эксперименте.

Через ряд последовательных превращений из молекулы фруктозы образуются 2 молекулы триозофосфатов, которые либо распадаются по гликолитическому пути с получением энергии, либо конденсируются с образованием фруктозо-1,6-дисфосфата и затем участвуют в глюконеогенезе. Все это может способствовать избыточному накоплению глюкозы и, соответственно, усилению синтеза инсулина.

Таким образом, изучаемые высококалорийные диеты приводят к изменениям в углеводном и липидном обмене у крыс. Наибольшие нарушения вызывает диета, содержащая повышенное количество жиров, в силу особенностей их метаболизма в организме животных.

Сопоставление с другими публикациями

Ранее учеными были проведены схожие исследования по изучению влияния фруктозы на метаболизм с целью моделирования метаболического синдрома [12]. Исследованиями I.S. Hwang и соавт. (1987) было показано, что диета, содержащая фруктозу (66% суточного рациона), у крыс индуцирует формирование дислипидемии, гипертензии [13]. Данный тип диеты мы взяли за основу в нашей работе.

Другие авторы использовали фруктозу в растворе для питья [14]. В этом случае также наблюдалось развитие отдельных признаков метаболического синдрома. Но в целом ученые пришли к выводу, что наибольший эффект достигается при использовании фруктозы в сухом корме [15].

Были проведены работы по моделированию сахарного диабета 2 типа на основе высокожировой диеты (55% калорийности) и однократного внутрибрюшинного введения стрептозотоцина (35 мг/кг) [16]. В данной модели авторы наблюдали изменения в показателях углеводного обмена, а также в липидном и белковом метаболизме. Но стрептозотоцин известен как диабетогенный цитотоксин и во многих работах используется для экспериментального воспроизведения сахарного диабета 2 типа [17]. В нашей работе мы изучали изменения в липидном и углеводном обмене только на фоне диеты без введения аналогичных препаратов.

Другие авторы для индуцирования метаболических нарушений в течение 6 нед назначили крысам высококалорийную диету, включающую «жир свиной (15% по массе), манную кашу на молоке (30%), муку пшеничную и белый хлеб (15%), сахарный песок (5%), животные жиры (маргарин с гидрогенизированными жирами, майонез, сыр) (25%), стандартный сухой корм ООО «Лабораторкорм» (10%). В качестве питья животные получали 10% р-р глюкозы» [18]. По результатам исследования наблюдалось повышение концентрации ХС, ЛПНП, ТГ и снижение уровня ЛПВП. Но не исследовались показатели углеводного обмена. Тем не менее такое кормление животных пищей, обогащенной жирами и углеводами, может быть использовано для моделирования метаболического синдрома.

Клиническая значимость результатов

В ранее проведенных исследованиях либо по моделированию симптомов метаболического синдрома, либо по изучению нарушений в углеводном и липидном метаболизме авторы ограничивались одним типом диеты и обменных нарушений. Задача нашей работы заключалась в создании диет на основе фруктозы и жира, сравнительном анализе полученных результатов, формировании целостного представления в плане возможного последующего моделирования метаболического синдрома и дальнейшего изучения различного рода патологий на его основе.

Ограничения исследования

Ограничения при обосновании исследования могут быть связаны с вероятностью несоответствия теоретических размышлений практическим выводам.

Ограничения в условиях проведения эксперимента

Поскольку не было возможности содержать крыс по 1 особи в клетке, могли возникнуть ограничения в потреблении корма животными в течение дня. Помимо этого, индивидуальные особенности крыс в плане выбора еды, объема питания, обменных процессов привнесли некоторые погрешности в исследование. Условия декапитации животных, забора крови, качество получения сыворотки для исследования могли быть причиной смещения результатов.

Указанные смещения ограничения могли повлиять на результаты только с позиции их статистической значимости, динамика изменений осталась бы прежней.

Направления дальнейших исследований

В дальнейшем планируется исследование метаболизма других соединений, в частности, неколлагеновых белков соединительной ткани на фоне высокожировой и фруктозообогащенной диеты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Диета как с повышенным содержанием животного жира, так и фруктозы, которая повсеместно используется как источник простых углеводов, приводит к метаболическим изменениям в липидном и углеводном обмене. При этом корм с высоким содержанием жира в большей степени вызывает увеличение показателей липидного, а обогащенный фруктозой — углеводного обмена. Полученные результаты могут послужить поводом внесения корректировок в рацион питания в сторону ограничения употребления высококалорийных продуктов в отдельных случаях.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Работа выполнена по инициативе авторов без привлечения финансирования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с содержанием настоящей статьи.

Участие авторов. Гилева О.Г. — вклад автора по критерию 1, по критерию 2; Бутолин Е.Г. — вклад автора по критерию 1, по критерию 2; Терещенко М.В. — вклад автора по критерию 1; Иванов В.Г. — вклад автора по критерию 1. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы.