Evaluation of the metabolism properties of choline kinase alpha in neoplasms of the parathyroid glands. A pilot study

Cover Page

Abstract


BACKGROUND: Primary hyperparathyroidism (PHPT) is a widespread endocrine disease characterized by excessive production of parathyroid hormone (PTH) due to parathyroid gland hyperplasia (PGH) or tumor lesions (adenoma or cancer of the parathyroid gland (PG) in 80% and 1–5% of cases respectively). Choline kinase α–alpha (XKα) overexpression is described in tumors of different localization, but there is no data on its expression in PG tumors.

AIMS: To study the character of XKα expression in PG neoplasms and its relationship with clinical, laboratory, and visualization characteristics (positron emission tomography combined with computed tomography (PET/CT) with 18F–fluorocholine (18F–FC)).

MATERIALS AND METHODS: The material for the study was based on tissue samples from 10 patients of 34–70 years old (Me = 61.5; [48; 66]), with a laboratory–confirmed diagnosis of PHT. An immunohistochemical study (IHC) was carried out on materials from 2 patients with hyperplasia of the main cells, from 5 patients with adenoma of PG, from 1 patient with atypical adenoma and 1 with carcinoma of PG; in 1 case the metastasis of cancer of the neck with lymph node was examined.

RESULTS: The expression of XKα is spotted in all types of PG cells (chief cells: active and inactive forms), transitional forms between the chief cells and oxyphil; oxyphil cells, but it was most intense in active chief cells. The expression of XKα was observed in neoplasms of PG of various degrees of malignancy. In the most numerous group of PG formations with a favorable prognosis (11 samples from 7 patients), no statistically significant correlation (p> 0.05) was obtained between the intensity expression of the XKα, of the PTH and the proliferative activity index Ki–67, the level of radiopharmaceutical accumulation in PET/CT with 18F–FC (SUVmax) and laboratory data (PTH, Ca, Ca++).

CONCLUSIONS: In the majority of investigated cases, moderate and intensive expression of the XKα was detected in PG cells. A small amount of studied cases does not allow us to identify the connection between the intensity of XKα expression and the malignant potential for the formation of PG.


ОБОСНОВАНИЕ

Первичный гиперпаратиреоз (ПГПТ) – широко распространенное эндокринное заболевание, характеризующееся избыточной продукцией паратиреоидного гормона (ПТГ), а также верхненормальным или повышенным уровнем кальция в крови вследствие гиперплазии или опухолевого поражения околощитовидных желез (ОЩЖ). Причиной развития ПГПТ в большинстве случаев является аденома ОЩЖ (около 80%), реже – первичная гиперплазия, рак ОЩЖ диагностируется лишь у 1–5% пациентов [1–2]. Учитывая неуклонный рост заболеваемости ПГПТ, можно прогнозировать, что и выявляемость злокачественных новообразований ОЩЖ будет расти. По данным американского регистра SEER (Surveillance, Epidemiology, and End Results), в США за 16 лет наблюдения (с 1988 по 2003 гг.) был зафиксирован рост заболеваемости раком ОЩЖ (с 1988 по 1991 гг. – 3,58 на 10 млн населения; с 2000 по 2003 гг. – 5,73 на 10 млн населения) [3]. Эпидемиологические данные указывают на необходимость поиска новых маркеров прогноза заболевания и потенциальных терапевтических мишеней.

Холинкиназа (ХK), открытая в 1953 г. Wittenberg и Kornberg [4], является первым ферментом в цикле Кеннеди [5] биосинтеза фосфатидилхолина (ФХ). ФХ – главный липид мембран эукариотических клеток, необходимый для обеспечения их структурной стабильности и способности к пролиферации [6]. ХK локализуется в цитоплазме клетки и катализирует реакцию трансформации холина в фосфохолин (ФХо) с использованием молекулы АТФ и Mg2+ в качестве кофактора. ФХо под действием фермента цитидиндифосфат-фосфохолинцитидилтрансферазы далее фосфорилируется до цитидиндифосфатхолина (ЦДФ-холин), затем в другие промежуточные соединения перед включением в фосфолипиды клеточной мембраны в виде ФХ [7–8].

У млекопитающих существует 3 изоформы ХК (ХКα1, ХКα2 и ХКβ), кодируемые двумя разными генами – CHKA и CHKB. Данные гены у людей расположены в хромосомах 11q13.2 и 22q13.33 соответственно [7–9]. Оба гомодимера ХКα1 и ХКα2 обладают как холин- , так и этаноламин-киназной активностью. Гомодимер ХКβ преимущественно обладает этаноламин-киназной активностью, а гетеродимер ХКα-ХКβ имеет промежуточную специфичность [7–8].

Кроме своей основной роли в метаболизме липидов клеток, ХК, предположительно, участвует в регуляции клеточной пролиферации и в канцерогенезе.

Аргументом в пользу существенной роли ХК в канцерогенезе является повышение ФХо во время трансформации клеток, опосредованной онкогеном RAS [8–10]. Вероятно, повышенная активность ХК в злокачественных опухолях является результатом гиперэкспрессии ХКα. В свою очередь, это может привести к более высокой доле димеров ХКα–ХКα и, соответственно, к более высокой активности ХК, чем у гетеродимеров ХКα–ХКβ или гомодимеров ХКβ–ХКβ [7]. Существует гипотеза о влиянии ХКα на пролиферацию и трансформацию клеток путем регулирования смены фаз клеточного цикла G1–S и сигналов к апоптозу [11]. Гиперэкспрессия ХКα зафиксирована в опухолях молочной железы, легкого, толстой кишки, мочевого пузыря и предстательной железы человека[11–14].

Выраженная экспрессия ХКα в опухолевых клетках позволяет рассматривать ее как возможную мишень для терапевтического воздействия [15]. Lacal и соавт. в 1997 г. впервые предложили использовать ингибиторы CHKα в качестве потенциальной противоопухолевой терапии [15]. На сегодняшний день существует несколько поколений ингибиторов ХКα (MN58b, TCD–717) [7, 15, 16].

Радиоизотопное мечение холина дает возможность использовать его в качестве ПЭТ-индикатора. Во время фосфорилирования изотопная метка остается внутри клетки, что позволяет визуализировать ее метаболизм. В 2012 г. при проведении позитронно-эмиссионной томографии, совмещенной с компьютерной томографией (ПЭТ/КТ) с 11С-холином, у больного раком предстательной железы была случайно выявлена опухоль ОЩЖ, а впоследствии диагностирован ПГПТ. Такая же находка у пациента с аналогичным диагнозом продемонстрирована и при проведении ПЭТ/КТ с 18F-фторхолином (18F-ФХ). Эти случаи показали возможность использования меченого холина для визуализации патологически измененных ОЩЖ [17–20]. В то же время оценка выраженности экспрессии ХКα с помощью иммуногистохимического (ИГХ) метода зарекомендовала себя при анализе образцов тканей опухолей молочной железы, легких и предстательной железы [21–22]. Ряд исследователей связывают степень и характер экспрессии ХКα с прогнозом заболевания [12, 14, 16]. Большинство из них склонны расценивать гиперэкспрессию ХКα как неблагоприятный прогностический фактор [12, 14, 23]. В настоящее время отсутствуют сведения об особенностях экспрессии ХКα в новообразованиях ОЩЖ.

Нам представляется важным сбор данных об уровне накопления радиофармпрепарата (РФП) при ПЭТ/КТ с 18F-ФХ (SUVmax) в ОЩЖ и степени экспрессии ХКα в тканях удаленных образований.

ЦЕЛЬ

Изучить характер и интенсивность экспрессии ХКα в новообразованиях ОЩЖ, выявить взаимосвязь между полученными характеристиками с клиническими, лабораторными данными (уровень ПТГ, Са, Са++) и уровнем накопления РФП при ПЭТ/КТ с 18F-ФХ.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

В обсервационное одномоментное неконтролируемое многоцентровое пилотное исследование включены 10 пациентов в возрасте от 37 до 70 лет. Хирургическое лечение ПГПТ в условиях ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России проведено 9 пациентам и 1 – в ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. ПЭТ/КТ с 18F-ФХ на предоперационном этапе выполнено 8 больным в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

На срезах c парафиновых блоков проводили ИГХ-исследование с антителами к ПТГ, маркеру пролиферации Ki-67 и ХКα.

Интенсивность и характер экспрессии ХКα оценивались в гиперплазированных ОЩЖ и в новообразованиях ОЩЖ разной степени злокачественности. При смешанном клеточном составе образований особенности экспрессии ХКα оценивались отдельно в каждой клеточной популяции.

Критерии соответствия

В исследование вошли пациенты старше 18 лет с подтвержденным диагнозом ПГПТ, которым выполнено радикальное хирургическое лечение, что было подтверждено результатами лабораторного обследования (нормализация уровня ПТГ и Са, Са++ в послеоперационном периоде). Морфологическая диагностика новообразований ОЩЖ проводилась в соответствии с критериями классификации опухолей эндокринных органов (ВОЗ, 2017).

Условия проведения

Оценка гистологических препаратов и ИГХ-реакции выполнена двумя патологами независимо с последующим обсуждением результатов и вынесением коллегиального заключения.

В исследование вошли пациенты, наблюдавшиеся и оперированные в ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России и в ГБУЗ МО «МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского». ПЭТ/КТ проводилось в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Продолжительность исследования

Исследование проводилось с 2017 по 2018 гг.

Основной исход исследования

Основным результатом исследования считалось подтверждение наличия или отсутствия экспрессии ХКα в ткани новообразования ОЩЖ.

Дополнительные исходы исследования

В ходе исследования также были оценены следующие параметры: анализ связи характера экспрессии ХКα в новообразованиях ОЩЖ с клиническими, лабораторными и визуализационными характеристиками (уровень накопления 18F-ФХ при ПЭТ/КТ).

Анализ в подгруппах

Для анализа полученных результатов мы выделили 3 группы: I – образования ОЩЖ с благоприятным прогнозом (10 образцов от 7 пациентов): аденомы (5 пациентов), гиперплазии ОЩЖ (2 случая; суммарно 5 ОЩЖ), II – новообразование с неопределенным потенциалом злокачественности (1 атипическая аденома) и III – злокачественные образования, включавшая 2 пациентов (1 случай – рак ОЩЖ и 1 случай – метастаз карциномы ОЩЖ в лимфатический узел шеи) (табл. 1). Сопоставление полученных результатов между группами не производилось ввиду слишком маленькой выборки. В группе I был проведен корреляционный анализ между лабораторными, визуализационными и морфологическими показателями. В случаях, когда у 1 пациента в патологический процесс было вовлечено несколько желез, лабораторные показатели дублировались для тех ОЩЖ, которые имели уровень SUV max более 1.

 

Таблица 1. Результаты морфологического и ИГХ-исследования и параметры ПЭТ/КТ с 18F-ФХ

Пациент №

Морфологические данные

Результаты ИГХ-исследования

Параметры ПЭТ/КТ с 18F–ФХ

Размер в максимальном измерении, мм

Вес, мг

Гистологический диагноз

Клеточный состав.

При смешанном клеточном составе тип клеток указан через «/»

Интенсивность

экспрессии ПТГ

Интенсивность

экспрессии ХКα.

В случае смешанного клеточного состава степень экспрессии указана через «/»

Интенсивность

экспрессии ХКα

H-score

Индекс пролиферации Ki-67, %

SUVmax (через 45 мин)

1

А.40 (правая нижняя)

74

ГклГ

аГК*

2

3

300

1

17,09

Б.7 (левая верхняя)

НД

ГклГ

аГК*/наГК

3

4и 2*/2

280

2

2,74

В.5 (левая нижняя)

НД

ГклГ

аГК*

4

4

400

1

1

2

А.35 (левая верхняя)

НД

ГклГ

аГК*/ O

2

3*/2

300

3

6,0

Б.55 (нижняя правая)

89

ГклГ

аГК*/О

2

3*/2

255

4

10,6

3

45

94

А

аГК*

4

2

200

3

8,6

4

40

63

А

аГК*/наГК

3

1*/3

140

3

8,11

5

10

10

А

аГК*/наГК

3

3*/2

270

1

2,11

6

55

50

А

аГК*

3

3

300

4

10,12

7

45

57

А

аГК*/наГК/О

3

4 и3*/3/3

310

4

9,0

8

45

45

АА

О*/оГК*

3

2*/3*

250

22

4,39

9

30

НД

Р

аГК*/наГК

НД

4, 3*,2 /2

280

11

НД

10

НД

НД

Mts Р в л/у

аГК*

НД

2

200

33

НД

А – аденома; ГклГ – главноклеточная гиперплазия; АА – атипическая аденома; Р – рак; Mts Р в л/у – метастаз рака в лимфатический узел; аГК – активные главные клетки; наГК – неактивные главные клетки; ОК – оксифильные клетки; оГК – переходная форма между ГК и ОК; * – преобладающий тип клеток; */* – типы клеток представлены в равных пропорциях; НД – нет данных.

 

Методы регистрации исходов

Визуализацию образований ОЩЖ с помощью ПЭТ/КТ с 18F-ФX проводили по стандартной методике через 40 минут после внутривенного введения РФП (с предварительным соблюдением бесхолиновой диеты в течение 48 ч, натощак). Исследования выполняли на ПЭТ-камерах фирмы Siemens (Biograph mCT40).

Для измерения поглощения статичных изображений использован стандартизированный уровень накопления по максимальным значениям (SUV maх (the standardized uptake value)), определяемый как отношение радиоактивности пикселя к введенной радиоактивности, нормализованной по весу.

ИГХ-исследование проведено с использованием первичных антител (АТ) для ПТГ (клон MRQ-31; RTU; Cell Marque, США) и Ki-67 (клон MIB-1; разведение 1:100; Dako, Великобритания) по протоколам в соответствии с рекомендациями производителей. Для ХКα протокол отличался от рекомендованного и был подобран исходя из качества («чистоты») и выраженности ИГХ-реакции на образцах с показателем SUVmax выше 1 (polyclonal; разведение 1:10; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA или Novus Biologicals, LLC, USA; температурное восстановление антигена в растворе со слабощелочной реакцией pH, инкубация с первичными антителами в течение 2 ч). Для визуализации использована безбиотиновая DAB-система детекции.

Оценка экспрессии ПТГ и ХКα производилась полуколичественным методом по степени интенсивности цитоплазматического окрашивания: 0 «–» – отсутствие реакции, 1 «+» – слабая, 2 «+» – умеренная, 3 «+» – выраженная, 4 «+» – высокоинтенсивная. Также мы использовали H-score для интерпретации результатов ИГХ-реакции с антитезами к ХКα, рассчитывая значения по формуле (1 × [% клеток 1 «+»]) + (2 × [% клеток 2 «+»]) + (3 × [% клеток 3 «+»])+ (4 × [% клеток 4 «+»]) [24]. Таким образом, при оценке ИГХ-реакции по шкале H-score уровень экспрессии находился в диапазоне 0 до 400.

Определение индекса Ki-67 рассчитано по стандартной методике, как среднее количество меченных этим маркером ядер, которое оценивается в процентах на 100 подсчитанных ядер опухолевых клеток, при учете 1000 клеток в репрезентативных полях зрения при большом увеличении (×400).

Этическая экспертиза

Все пациенты подписывали добровольное информированное согласие на использование биологического материала в научных целях и на обработку персональных данных.

Статистический анализ

Принципы расчета размера выборки

Объем выборки предварительно не рассчитывался.

Методы статистического анализа данных

Расчеты проводились при помощи пакета программы Statistica 12.

Описание количественных данных приведено в виде минимального и максимального значений, медианы (Me), 25 и 75 перцентилей. Взаимосвязь между полученными данными оценена с помощью коэффициента корреляции Спирмена (rs). Статистически значимыми считались результаты при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Объекты (участники) исследования

В исследование вошли 10 пациентов в возрасте от 34 до 70 лет (Me 61,5 [48;66]). Все пациенты имели лабораторно подтвержденный диагноз ПГПТ.

Основные результаты исследования

Лабораторные данные

Уровни ПТГ и Са были измерены 10 пациентам, уровень Са++ определяли 9 больным. В I группе значения ПТГ определялись в диапазоне от 215,4 до 1983 пг/мл (Me 1298 [279,3;1682]), Са – от 2,84 до 4,09 ммоль/л (Me 3,18 [2,99;3,24]), Са++ – от 1,36 до 1,91 (Me 1,44; [1,36;1,62]) ммоль/л. Во II когорте уровень ПТГ составил 2500 пг/мл, Са – 4,1 ммоль/л, измерение уровня Са++ не проводилось. В III группе у пациента с раком ОЩЖ и у больного с метастазом карциномы ОЩЖ уровень ПТГ составил 1049 и 291 пг/мл, Са – 2,59 и 3,14 ммоль/л, Са++ – 1,18 и 1,49 ммоль/л соответственно (табл. 1).

Результаты ПЭТ/КТ с 18F-ФХ

ПЭТ/КТ с 18F-ФХ проведена 8 пациентам, 2 пациентам с карциномами данное исследование не выполнялось. В 2 случаях из 8 у 1 больного визуализировалось 2 образования ОЩЖ. SUVmax был зафиксирован в диапазоне 2,11–17,09 (Me 8,355 [4,39;10,12]) (см. табл. 1). В 1 случае интраоперационно было заподозрено, что в патологический процесс дополнительно вовлечена ОЩЖ, в которой не определялось повышенного накопления РФП, что, вероятно, связано с малым размером (5 мм), в данном случае уровень SUVmax был принят за 1 (см. табл. 1).

Морфологическое исследование

У 2 пациентов было удалено более одной ОЩЖ. Таким образом, для морфологического исследования доступно 13 образцов ткани ОЩЖ (см. табл. 1). Материал исследован от 2 пациентов с морфологическим диагнозом «главноклеточная гиперплазия» (в одном случае в патологический процесс было вовлечено 3, во втором – 2 ОЩЖ), 5 случаев с диагнозом «аденома ОЩЖ», 1 пациент с атипической аденомой, 1 пациент с карциномой ОЩЖ, в 1 случае исследовали метастаз рака ОЩЖ в лимфатический узел шеи (см. табл. 1).

Результаты иммуногистохимического исследования

ИГХ-исследование экспрессии ХКα

При проведении ИГХ-реакции мы наблюдали в клетках преимущественно цитоплазматическое окрашивание; очаговое мембранное окрашивание отмечено в 1 случае и в 2 случаях – мембранно-цитоплазматическое, в 1 случае очагово отмечалось окрашивание по типу «dot like».

Анализируя ИГХ-реакцию с АТ к ХКα, мы отметили различия в интенсивности экспрессии данного маркера и в локализации иммунореактивного материала в клетках, которая могла различаться как в пределах одного клеточного пула, так и в разных типах клеток (главные клетки: активные (аГК) и неактивные (наГК) формы, переходная форма между главными клетками и оксифильными (оГК); оксифильные (О) клетки).

Экспрессия ХКα была выявлена во всех типах клеток, но наиболее интенсивной она была в аГК (см. табл. 1, рис. 1 и 2). Экспрессия ХКα наблюдалась в новообразованиях ОЩЖ различной степени злокачественности (см. табл. 1, рис. 3 и 4).

 

Рисунок 1. Экспрессия холинкиназы альфа (ХКα) в различных клеточных пулах в одном тканевом образце.

 А–В – случай № 1Б; А – аГК и наГК (Г–Э ×200); Б и В – экспрессия ХКα интенсивная (4 «+») в аГК и умеренная (2 «+») в наГК (×200 и ×400 соответственно); Г–Е – случай №7; Г – аГК, формирующие различные структуры (фолликулярные и трабекулярные); Д и Е – различная степень экспрессии ХКα в 4 «+» и 3 «+» в аГК (×200 и ×400 соответственно); Ж–И – случай № 7; Ж–О и ГК в разных фазах секреторного цикла (аГК и наГК) (Г–Э×100); З и И – выраженная (3+) экспрессия ХКα в обоих типах клеток (×200 и ×400 соответственно).

 

Рисунок 2. Распределение экспрессии холинкиназы альфа в баллах в зависимости от типа клеток образований ОЩЖ.

 

Рисунок 3. Распределение экспрессии холинкиназы альфа в баллах по преобладающей экспрессии (в баллах) в клетках в зависимости от степени злокачественности образований околощитовидных желез.

 

Рисунок 4. Экспрессия холинкиназы альфа (ХКα) в различных по степени злокачественности новообразованиях околощитовидных желез.

А и Б – главноклеточная гиперплазия ОЩЖ (случай №1В), клетки которой обладают интенсивной (4+) экспрессией ХКα (А. Г–Э ×200; Б. ИГХ × 200); В и Г – аденома ОЩЖ из главных клеток (случай №6), обладающая выраженной (3+) экспрессией ХКα (В. Г–Э ×200; Г. ИГХ ×200); Д и Е – карцинома ОЩЖ (случай №9) с умеренной (2+) и выраженной (3+) экспрессией ХКα (Д. Г–Э ×300; Е. ИГХ ×200); Ж и З – метастаз рака ОЩЖ в лимфатический узел (случай №10), умеренно (2+) экспрессирующий ХКα (Ж. Г–Э ×400; З. ИГХ ×400).

 

ИГХ-исследование экспрессии ПТГ

ИГХ-анализ с АТ к ПТГ был проведен во всех образцах, кроме злокачественных образований ОЩЖ. Интенсивная экспрессия ПТГ наблюдалась в I и II группах (см. табл. 1).

Уровень экспрессии маркера пролиферации Ki-67

Значение индекса пролиферации Ki-67 в группе образований ОЩЖ с благоприятным прогнозом составило 1–4% (Me 3% [1;4]), в атипической аденоме он был равен 22%, в карциноме – 11%, а в метастазе рака ОЩЖ в лимфатический узел составил 33% (см. табл. 1).

Дополнительные результаты исследования

Мы оценили наличие взаимосвязи между лабораторными (уровень ПТГ, Cа и Cа++, уровнем накопления РФП при ПЭТ/КТ (SUVmax)) и ИГХ (экспрессия ХКα, ПТГ, индекс Ki-67) показателями в I, наиболее многочисленной (7 наблюдений) группе пациентов. При этом не получено статистически значимой (p>0,05) корреляции между экспрессией ХКα как по преобладающему типу клеток, так и по клеточному очагу с наибольшей интенсивностью экспрессии ПТГ и при расчете экспрессии по шкале H-score, с индексом Ki-67 (р=0,665; p=0,736; p=0,739 соответственно), c экспрессией ПТГ клетками опухоли (p=0,315; p=0,672; p=0,755 соответственно), с уровнем накопления РФП при ПЭТ/КТ с 18F-ФХ (SUVmax) (p=0,850; p=0,296; p=0,774 соответственно) и лабораторными данными: ПТГ (p=0,777; p=0,718; p=0,394), Са (p=0,837; p=0,899; p=0,394 соответственно), Са++ (p=0,566; p=0,717; p=0,985 соответственно).

Дополнительное наблюдение, выявленное в ходе исследования

Анализируя ИГХ-реакцию с АТ к ХКα, мы обратили внимание на интенсивную экспрессию (4 «+») данного маркера в отдельных клетках (не паратиреоцитах) в периваскулярной зоне (рис. 5), в большинстве исследуемых образцов. Для того чтобы раскрыть природу данного явления, необходимы дальнейшие исследования.

 

Рисунок 5. Выраженная (3+) экспрессия холинкиназы альфа в ткани аденомы околощитовидных желез и очень интенсивная (4+) в отдельных клетках периваскулярной зоны (×200).

 

Нежелательные явления

Нежелательные явления не зарегистрированы.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

Экспрессия ХКα отмечена во всех типах клеток ОЩЖ (аГК, наГК, оГК; О), с максимальной интенсивностью (4 «+») в аГК. Экспрессия ХКα наблюдалась в новообразованиях ОЩЖ различной степени злокачественности.

Обсуждение основного результата исследования

При проведении ИГХ-исследования мы выявили преимущественно цитоплазматическую реакцию с антителами к ХКα, в 3 случаях – мембранную. Однако ряд исследователей отмечали и учитывали не только цитоплазматическое окрашивание, но и ядерное [16–25]. Contractor К. и соавт. при ИГХ-исследовании указали наличие ядерного окрашивания в 1 из 20 раков предстательной железы и в 1 случае простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН). Mazarico J.M. и соавт. сообщают о ядерном окрашивании в 43% (всего 96 пациентов) протоковых аденокарцином поджелудочной железы, что в приведенной работе было связано с более благоприятным прогнозом [16]. Феномен наличия ядерной экспрессии ХКα еще не до конца изучен. Существует несколько гипотез: 1) наличие ядерной экспрессии обусловлено способностью ХКα фосфорилироваться и перемещаться в ядро вместе с другими белками [25]; 2) ХКα может транслоцироваться в ядро для синтеза эндонуклеарного фосфатидилхолина [12]. Мембранная экспрессия, по нашему мнению, может быть обусловлена перемещением ХКα к месту ее непосредственного функционального использования либо оттеснением этого фермента к периферии крупными внутриклеточными вакуолями и/или включениями. На сегодняшний день не решен вопрос о единой методике оценки экспрессии данного маркера. Так, в одних работах учитывалась только интенсивность экспрессии ХКα [12, 26], а в других принимали во внимание не только интенсивность, но и количество иммунопозитивных клеток [14, 16, 23]. При этом способы оценки количества и интенсивности экспрессии фермента у разных групп исследователей различались.

В данной работе выраженная экспрессия ХКα наблюдалась как в группе образований ОЩЖ с благоприятным прогнозом, так и в группе с неопределенным потенциалом злокачественности и в злокачественных новообразованиях. К сожалению, сопоставление полученных результатов по группам не производилось ввиду малой выборки. Большинство авторов отмечают, что в опухолях наблюдается более интенсивная экспрессия ХКα, чем в тканях без патологических изменений [12, 16, 25]. Однако встречаются работы с противоположными результатами. В пилотном исследовании Kwee S.A. и соавт. в 5 холангиокарциномах была выявлена умеренная экспрессия ХКα в 2 балла (использовалась шкала от 0 до 3 баллов); в 3 случаях в неизмененной ткани печени экспрессия ХКα была сравнимой по интенсивности (2 балла), в двух других оценена в 1 балл [26]. Тем не менее наличие интенсивной экспрессии ХКα в доброкачественных образованиях, а также тот факт, что в ряде случаев при низком уровне SUVmax мы выявили интенсивную экспрессию ХКα, позволили нам рассмотреть ХКα как потенциальный маркер функциональной активности ОЩЖ, участвующий в механизмах секреции ПТГ клетками ОЩЖ. Так, паратиреоциты при активном синтезе ПТГ увеличивают свой объем, а выход везикул с гормоном и разрыв клеточной мембраны требуют быстрого и массивного ее восстановления [27]. Можно предположить, что увеличение поверхности клеточной стенки приводит к интенсивному захвату холина и, следовательно, к более интенсивному уровню накопления 18F–ФХ при проведении ПЭТ/КТ. Для синтеза ФХ из холина расходуется запас ХКα, а, следовательно, снижается уровень ее экспрессии в ткани. Таким образом, в гормонально более активных клетках уровень экспрессии ХКα будет ниже при более высокой степени накопления 18F-ФХ при ПЭТ/КТ. Гипотезу об экспрессии ХКα и функциональной активности клеток можно косвенно подтвердить результатами нашего исследования, поскольку максимальная экспрессия данного маркера (4 «+») определялась в активных клетках. При этом аГК с экспрессией ХК в 4 балла преобладали лишь в 1 случае и, возможно, характеризовали начало секреторного цикла, в то время как неактивные клетки накапливают вещества, необходимые для следующей фазы. В то же время в одной аденоме, где остаток ткани ОЩЖ был широко предоставлен, экспрессия ХКα была несколько более интенсивной в неизмененном ободке (рис. 6). Схожие различия в экспрессии между тканью аденомы и ободком нормальной ОЩЖ выявлены в работе Haglund и соавт., где изучалась экспрессия ПТГ, которая чаще была более интенсивной в нормальной ткани ОЩЖ, нежели в клетках аденомы [28]. Различная степень экспрессии ХКα также может быть обусловлена ультраструктурными особенностями клеток ОЩЖ.

 

Рисунок 6. Аденома околощитовидных желез (случай №5)

А. Остаток ткани ОЩЖ (1) прилежит к ткани аденомы (2) преимущественно из главных клеток в разных фазах секреторного цикла, преобладают аГК (×50). Б. Выраженная (3 «+») экспрессия ХКα в ткани остатка ОЩЖ и выраженная (3 «+») и умеренная (2 «+») в ткани аденомы (×100)

 

Нельзя оставить без внимания и тот факт, что микроокружение опухоли (например, гипоксия или рН межклеточной среды) могут влиять на метаболизм холина [7, 29]. Характер экспрессии может быть связан не только с типом секреции, но и с гистогенезом клеточных линий. В пользу подобной гипотезы говорит наблюдение Mazarico J.M. и соавт., которые проанализировали экспрессию ХКα во внеопухолевой ткани поджелудочной железы [16]. Более выраженная реакция наблюдалась в островковых клетках, чем в протоковых и ацинарных [16]. Таким образом, предположение о ХКα как о возможном маркере гормональной активности клеток нуждается в дальнейших исследованиях на более обширном материале. Последующие работы, направленные на накопление данных о характере и особенностях экспрессии ХКα в образованиях ОЩЖ и взаимосвязи их с уровнем накопления РФП (SUVmax) при ПЭТ/КТ с 18F-ФХ, возможно, позволят использовать эти показатели в качестве дифференциально диагностических маркеров, факторов прогноза течения болезни и эффективности ответа на возможную терапию ингибиторами ХКα

Обсуждение дополнительных результатов исследования

В нашем исследовании не было выявлено статистически значимой корреляции между экспрессией ХКα и другими исследованными маркерами (экспрессия ПТГ и значение индекса пролиферации Ki-67). Отсутствие связи между экспрессией ХКα и значением индекса Ki-67 также было зафиксировано в работах Contractor K. и соавт. [25]. Результаты, полученные Aboagye и Bhujwalla [13], противоречат гипотезе о том, что высокий уровень ФХо является маркером повышенной пролиферативной активности клеток. В своей работе авторы, используя нормальные эпителиальные клетки ткани молочной железы и простаты с помощью гормона роста, ускорили их клеточное деление до уровня, характерного для раковых клеток, и получили уровень ФХо ниже, чем это наблюдалось в раковых клетках [7, 13]. Аналогично этому Challapalli A. и соавт., исследовав 100 образцов рака предстательной железы и не обнаружив взаимосвязи между степенью экспрессии ХК и индексом пролиферации Ki-67, высказали предположение, что ХК может быть независимым маркером рака предстательной железы, который не отражает пролиферативную активность его клеток [12].

Мы не получили статистически значимой корреляции между экспрессией ХКα и уровнем накопления РФП при ПЭТ/КТ с 18F-ФХ (SUVмах) в группе доброкачественных образований ОЩЖ. В то время как Contractor K. и соавт. продемонстрировали прямую сильную зависимость между SUVmax [11C]choline ПЭТ/КТ и интенсивностью ИГХ-реакции с антителами к ХКα в карциномах предстательной железы (r=0,63; p=0,0004) [25]. Данное противоречие может объясняться как малой выборкой в нашем исследовании, так и различным потенциалом злокачественности исследуемых образований (в нашей когорте ПЭТ/КТ с 18F-ФХ не было выполнено ни одному пациенту со злокачественным новообразованием).

В данной группе мы также не выявили статистически значимой (p>0,05) корреляции между экспрессией ХКα и лабораторными показателями (ПТГ, Са Са++).

Ограничения исследования

Ограничением данного исследования являются малый объем выборки, проведение ПЭТ/КТ с 18F-ФХ пациентам только с доброкачественными образованиями ОЩЖ, отсутствие в выборке тканей нормальных ОЩЖ и с подавленной функцией, недостаток данных о возможных положительных внутренних контролях, субъективность оценки результатов ИГХ-исследования, отсутствие единого стандартизованного протокола проведения ИГХ-реакции с антителами к ХКα и метода регистрации результатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В проведенном исследовании мы показали, что даже при отсутствии накопления 18F-ФХ при ПЭТ/КТ клетки ОЩЖ экспрессируют ХКα. В большинстве случаев была выявлена умеренная и интенсивная экспрессия ХКα в ткани ОЩЖ. Небольшое количество исследований и малая выборка не позволяют нам выявить зависимость между особенностями экспрессии ХКα и злокачественным потенциалом образований. В ходе эксперимента в наиболее многочисленной группе образований ОЩЖ с благоприятным прогнозом (11 образцов от 7 пациентов) не выявлено статистически значимой корреляции между интенсивностью экспрессии ХКα в клетках образований, лабораторными данными и уровнем накопления 18F-ФХ при ПЭТ/КТ. Однако на основе полученных данных можно высказать гипотезу о том, что экспрессия ХКα может характеризовать гормональную активность клеток ОЩЖ.

Принимая во внимание отсутствие достаточного количества данных о визуализации ОЩЖ с помощью ПЭТ/КТ с 18F-ФХ и его прогностическом значении, о наличии взаимосвязи показателя SUVmax с интенсивностью экспрессии ХКα и потенциалом злокачественности в образованиях различной локализации и гистогенетического происхождения, дальнейшие исследования в этом направлении представляются перспективными и актуальными. Необходимо продолжить эти исследования с возможностью получить более обширные и углубленные данные, накопить опыт о значении и взаимозависимости всех изученных показателей в ткани ОЩЖ при различных патологических процессах.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Публикация настоящей работы поддержана государственным заданием «Наследственные опухолевые синдромы и множественные эндокринные неоплазии: персонализация диагностики и лечения, прогнозирование рисков, идентификация ядерных семей». Номер государственного учета НИОКТР АААА–А18–118051590057–2

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов. Мокрышева Н.Г. – разработка и руководство исследованием, концепция статьи, анализ литературных данных, написание и редактирование текста; Воронкова И.А. – анализ литературных данных, проведение морфологического исследования, подготовка микрофотографий, написание и редактирование текста; Крупинова Ю.А. – отбор и ведение пациентов, анализ литературных данных, написание и редактирование текста; Долгушин М.Б. – выполнение ПЭТ/КТ с 18F-ФХ, анализ литературных данных, написание и редактирование текста; Гуревич Л.Е. – анализ литературных данных, проведение морфологического исследования, отбор микрофотографий, редактирование текста.; Оджарова А.А. – выполнение ПЭТ/КТ с 18F-ФХ, анализ литературных данных, написание и редактирование текста; Кузнецов С.Н. – выполнение хирургического лечения, анализ литературных данных, редактирование текста; Крюкова И.В. – ведение пациента, анализ литературных данных, редактирование текста.

Все авторы внесли значимый вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию статьи перед публикацией.

Natalia G. Mokrysheva

Endocrinology Research Centre

Email: nm70@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9717-9742
SPIN-code: 5624-3875

Russian Federation, 11, Dm. Ulyanova street, Moscow, 117036

MD, PhD

Iya A. Voronkova

Endocrinology Research Centre; Moscows regional research clinical institute n.a. M.F. Vladimirskiy

Author for correspondence.
Email: iya-v@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6687-3240
SPIN-code: 9685-1371
Scopus Author ID: 8231177300

Russian Federation, 11, Dm. Ulyanova street, Moscow, 117036; 61/2, Shepkina street, Moscow, 129110

MD, PhD

Julia A. Krupinova

Endocrinology Research Centre

Email: j.krupinova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7963-5022
SPIN-code: 6279-8247

Russian Federation, 11, Dm. Ulyanova street, Moscow, 117036

MD

Mikhail B. Dolgushin

Blokhin Russian Cancer Research Center

Email: mdolgushin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3930-5998
SPIN-code: 6388-9644

Russian Federation, 23, Kashirskoye sh., Moscow, 115478

MD, PhD, Professor

Larisa E. Gurevch

Moscows regional research clinical institute n.a. M.F. Vladimirskiy

Email: larisgur@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9731-3649
SPIN-code: 8615-0038

Russian Federation, 61/2, Shepkina street, Moscow, 129110

PhD, Professor

Akgul A. Odzharova

Blokhin Russian Cancer Research Center

Email: odzharova07@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3576-6156
SPIN-code: 1074-3862

Russian Federation, 23, Kashirskoye sh., Moscow, 115478

MD, PhD

Sergey N. Kuznetsov

Endocrinology Research Centre

Email: kuznetsov_enc@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8558-7725
SPIN-code: 9870-2578

Russian Federation, 11 Dm.Ulyanova street, 117036 Moscow, Russia

MD, PhD

Irina V. Kryukova

Moscows regional research clinical institute n.a. M.F. Vladimirskiy

Email: kiv200877@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7876-5105
SPIN-code: 7669-3010

Russian Federation, 61/2, Shchepkina street, Moscow, 129110  

MD, PhD, Assistant Professor

  1. Favia G, Lumachi F, Polistina F, D’Amico DF. Parathyroid Carcinoma: Sixteen New Cases and Suggestions for Correct Management. World J Surg. 1998;22(12):1225-1230. doi: https://doi.org/10.1007/s002689900549
  2. Shane E. Parathyroid Carcinoma. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86(2):485-493. doi: https://doi.org/10.1210/jcem.86.2.7207
  3. Lee PK, Jarosek SL, Virnig BA, et al. Trends in the incidence and treatment of parathyroid cancer in the United States. Cancer. 2007;109(9):1736-1741. doi: https://doi.org/10.1002/cncr.22599
  4. Wittenberg J, Kornberg A. Choline phosphokinase. J Biol Chem. 1953;202(1):431-444. PMID: 13061469
  5. Gibellini F, Smith TK. The Kennedy pathway-De novo synthesis of phosphatidylethanolamine and phosphatidylcholine. IUBMB Life. 2010;62(6):414-428. doi: https://doi.org/10.1002/iub.337
  6. Zeisel SH. Dietary Choline: Biochemistry, Physiology, and Pharmacology. Daya S, ed. Annu Rev Nutr. 1981;1(1):95-121. doi: https://doi.org/10.1146/annurev.nu.01.070181.000523
  7. Glunde K, Bhujwalla ZM, Ronen SM. Choline metabolism in malignant transformation. Daya S, ed. Nat Rev Cancer. 2011;11(12):835-848. doi: https://doi.org/10.1038/nrc3162
  8. Патент РФ на изобретение № ٢٥٠٩٨٠٩/ ٢٠.٠٣.٢٠١٤ Бюл. № 8. Лакаль Акаль Санхуан Хуан Карлос, Рамирес де Молина Ана, Галлего Ортега Давид. Способы лечения и диагностики рака. [Patent RUS №2509809/ 20.03.2014. Byul. №8. Lakal’ Akal’ Sankhuan Khuan Karlos, Ramires de Molina Ana, Gallego Ortega David. Sposoby lecheniya i diagnostiki raka (In Russ)]. Доступно по http://www.fips.ru/cdfi/fips.dll/ru?ty=29&docid=2509809 Ссылка активна на 17.06.2019.
  9. HGNC [Internet]. HUGO Gene Nomenclature Committee. The resource for approved human gene nomenclature. [Last updated: 2019-06-16]. Available from: https://www.genenames.org/
  10. Ramírez de Molina A, Rodríguez-González A, Penalva V, et al. Inhibition of ChoK Is an Efficient Antitumor Strategy for Harvey-, Kirsten-, and N-ras-Transformed Cells. Biochem Biophys Res Commun. 2001;285(4):873-879. doi: https://doi.org/10.1006/bbrc.2001.5250
  11. Ramírez de Molina A, Gallego-Ortega D, Sarmentero-Estrada J, et al. Choline kinase as a link connecting phospholipid metabolism and cell cycle regulation: Implications in cancer therapy. Int J Biochem Cell Biol. 2008;40(9):1753-1763. doi: https://doi.org/10.1016/j.biocel.2008.01.013
  12. Challapalli A, Trousil S, Hazell S, et al. Exploiting altered patterns of choline kinase-alpha expression on human prostate tissue to prognosticate prostate cancer. J Clin Pathol. 2015;68(9):703-709. doi: https://doi.org/10.1136/jclinpath-2015-202859
  13. Aboagye EO, Bhujwalla ZM. Malignant transformation alters membrane choline phospholipid metabolism of human mammary epithelial cells. Cancer Res. 1999;59(1):80-84. PMID: 9892190
  14. Hu L, Wang R-Y, Cai J, et al. Overexpression of CHKA contributes to tumor progression and metastasis and predicts poor prognosis in colorectal carcinoma. Oncotarget. 2016;7(41):703-709. doi: https://doi.org/10.18632/oncotarget.11433
  15. Lacal JC. Choline kinase: a novel target for antitumor drugs. IDrugs. 2001;4(4):419-426. PMID: 16015482
  16. Mazarico JM, Sanchez-Arevalo Lobo VJ, Favicchio R, et al. Choline Kinase Alpha (CHK ) as a Therapeutic Target in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma: Expression, Predictive Value, and Sensitivity to Inhibitors. Mol Cancer Ther. 2016;15(2):323-333. doi: https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-15-0214
  17. Quak E, Lheureux S, Reznik Y, et al. F18-Choline, a Novel PET Tracer for Parathyroid Adenoma? J Clin Endocrinol Metab. 2013;98(8):3111-3112. doi: https://doi.org/10.1210/jc.2013-2084
  18. Hodolic M, Huchet V, Balogova S, et al. Incidental uptake of 18F-fluorocholine (FCH) in the head or in the neck of patients with prostate cancer. Radiol Oncol. 2014;48(3):228-234. doi: https://doi.org/10.2478/raon-2013-0075
  19. Cazaentre T, Clivaz F, Triponez F. False-Positive Result in 18F-Fluorocholine PET/CT Due to Incidental and Ectopic Parathyroid Hyperplasia. Clin Nucl Med. 2014;36(6):e328-e330. doi: https://doi.org/10.1097/RLU.0b013e3182a77b62
  20. Мокрышева Н.Г., Крупинова Ю.А., Долгушин М.Б., и др. Позитронная эмиссионная томография, совмещенная с компьютерной томографией с 18F- фторхолином в топической диагностике опухолей околощитовидных желез и вторичных изменений костной ткани при гиперпаратиреоидной остеодистрофии. Два клинических наблюдения // Проблемы эндокринологии. — 2018. — Т.64. — №5. — С.299-306. [Mokrysheva NG, Krupinova JA, Dolgushin MB, et al. Positron emission tomography in combination with computed tomography with 18F-fluorocholine in the topical diagnosis of parathyroid tumors and secondary changes in bone tissue associated with hyperparathyroid osteodystrophy: two case studies. Problems of Endocrinology. 2018;64(5):299–306. (In Russ).] doi: http://doi.org/10.14341/probl9548
  21. Gallego-Ortega D, Ramirez De Molina A, Gutierrez R, et al. Generation and characterization of monoclonal antibodies against choline kinase α and their potential use as diagnostic tools in cancer. Int J Oncol. 2006;109(9):1736-1741. doi: https://doi.org/10.3892/ijo.29.2.335
  22. Ramírez de Molina A, Gutiérrez R, Ramos MA, et al. Increased choline kinase activity in human breast carcinomas: clinical evidence for a potential novel antitumor strategy. Oncogene. 2002;21(27):4317-4322. doi: https://doi.org/10.1038/sj.onc.1205556
  23. Zhang L, Chen P, Yang S, et al. CHKA mediates the poor prognosis of lung adenocarcinoma and acts as a prognostic indicator. Oncol Lett. 2016;12(3):1849-1853. doi: https://doi.org/10.3892/ol.2016.4810
  24. Silva-Figueroa A, Villalobos P, Williams MD, et al. Characterizing parathyroid carcinomas and atypical neoplasms based on the expression of programmed death-ligand 1 expression and the presence of tumor-infiltrating lymphocytes and macrophages. Surgery. 2018;164(5):960-964. doi: https://doi.org/10.1016/j.surg.2018.06.013
  25. Contractor K, Challapalli A, Barwick T, et al. Use of [11C]Choline PET-CT as a Noninvasive Method for Detecting Pelvic Lymph Node Status from Prostate Cancer and Relationship with Choline Kinase Expression. Clin Cancer Res. 2011;17(24):7673-7683. doi: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-11-2048
  26. Kwee SA, Okimoto GS, Chan OT, et al. Metabolic characteristics distinguishing intrahepatic cholangiocarcinoma: a negative pilot study of (18)F-fluorocholine PET/CT clarified by transcriptomic analysis. Am J Nucl Med Mol Imaging. 2016;6(1):73-83.
  27. Mihai R. The Calcium Sensing Receptor: From Understanding Parathyroid Calcium Homeostasis to Bone Metastases. Ann R Coll Surg Engl. 2008;90(4):271-277. doi: https://doi.org/10.1308/003588408X286044
  28. Haglund F, Juhlin CC, Kiss NB, et al. Diffuse PTH expression in parathyroid tumors argues against important functional tumor subclones. Eur J Endocrinol. 2016;174(5):583-590. doi: https://doi.org/10.1530/EJE-15-1062
  29. Gillies RJ, Raghunand N, Karczmar GS, Bhujwalla ZM. MRI of the tumor microenvironment. J Magn Reson Imaging. 2002;16(4):430-450. doi: https://doi.org/10.1002/jmri.10181

Supplementary files

Supplementary Files Action
1. Figure 1. Expression of choline kinase alpha (XKα) in different cell pools in a single tissue sample. View (886KB) Indexing metadata
2. Figure 2. Distribution of choline kinase alpha expression in scores depending on the type of cells of the thyroid formations. View (67KB) Indexing metadata
3. Figure 3. Distribution of choline kinase alpha expression in points according to the prevailing expression (in points) in cells depending on the degree of malignancy of parathyroid gland formations. View (81KB) Indexing metadata
4. Figure 4. Expression of choline kinase alpha (XKα) in parathyroid neoplasms of varying degrees of malignancy. View (761KB) Indexing metadata
5. Figure 5. Expressed (3+) expression of choline kinase alpha in the tissue of the parathyroid adenoma and very intense (4+) in individual cells of the perivascular zone (× 200). View (187KB) Indexing metadata
6. Figure 6. Adenoma of the parathyroid glands (case No. 5) View (550KB) Indexing metadata

Views

Abstract - 148

PDF (Russian) - 24

Cited-By


Dimensions


Copyright (c) 2019 Mokrysheva N.G., Voronkova I.A., Krupinova J.A., Dolgushin M.B., Gurevch L.E., Odzharova A.A., Kuznetsov S.N., Kryukova I.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies